一.細胞介紹

L6成肌細胞株是Yaffe從甲基膽蒽存在下大鼠大腿肌的原代培養(yǎng)物最初兩代中分離得到。 L6細胞在培養(yǎng)基中融合形成多核的肌管和橫紋肌纖維。 細胞融合的程度隨著代數的增加而下降，因而細胞應冷凍于低代次階段并周期性地重新克隆以選擇融合能力強的細胞。 如果讓培養(yǎng)容器中的細胞長滿，這株細胞的成肌組分將迅速耗盡。 檢測表明肢骨發(fā)育畸形病毒(鼠痘)陰性。

二.細胞特性

（1）來源：大鼠 骨胳??；

（2）形態(tài)：成肌細胞，貼壁生長

（3）含量：>1x10?cells

（4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

（5）用途：僅供科研使用。

三.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備

（1）準備DMEM培養(yǎng)基   ，優(yōu)質胎牛血清 10% ，P/S1% 

（2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

四.運輸和保存

（1）凍存細胞：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）復蘇好的活細胞：T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

（1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

（2）請在4或5x顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據。

（3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

（4）注意：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

細胞處理：

（1）凍存細胞的復蘇：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

（2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8mL按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

（3）細胞凍存：收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面以T25瓶為例：

（1）細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個活細胞/mL。

（2）1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個活細胞/mL分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

（3）將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存，同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。