永生化大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（RLSEC）

產(chǎn)品編號(hào)：CL-058r

一、細(xì)胞特性

來源：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常肝組織

形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣，短梭形，貼壁生長

含量：>1x10?cells

規(guī)格：T25瓶x1（常溫運(yùn)輸）/ 含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管x2（干冰運(yùn)輸）

用途：本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用，不可用于動(dòng)物或人類治療或診斷用途

二、完全培養(yǎng)基及凍存液配制

1) 該細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：DMEM＋10%FBS＋1%P/S

2) 培養(yǎng)環(huán)境：37℃，95% Air，5% CO?；培養(yǎng)箱濕度為70%-80%

3) 凍存液：推薦使用非程序無血清細(xì)胞凍存液（貨號(hào)：RC-0102）

三、收貨注意事項(xiàng)

1) 收到細(xì)胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液體溢出及細(xì)胞有污染，凍存細(xì)胞若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落，請拍照后及時(shí)與我們聯(lián)系。

2) 75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱靜置約2-3h，在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)時(shí)，最好在低倍鏡（4x或5x物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度。看細(xì)胞的形態(tài)請?jiān)?0×和20×物鏡下，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3) 對于貼壁生長的細(xì)胞：靜置后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在運(yùn)輸過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若細(xì)胞密度未超過80%，可去除培養(yǎng)瓶中舊液（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中），加入新的完全培養(yǎng)基5mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（若培養(yǎng)瓶為密封瓶蓋須擰松瓶蓋）；若細(xì)胞密度超過80%，請立即傳代（若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收），首次傳代，建議 1:2 傳代（兩個(gè)T25瓶）。

細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

一、細(xì)胞復(fù)蘇

1. 將細(xì)胞凍存管快速放入37℃水浴中解凍，輕輕搖晃加速溶解，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁。

2. 將凍存管內(nèi)容物加入含有9mL完全培養(yǎng)基的離心管中，1000-1200rpm離心5min。

3. 棄去上清液，用1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到含有5-6mL完全培養(yǎng)基的T25瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意：在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和佩戴防護(hù)面罩，避免凍存管爆炸造成人員傷害。

二、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，即可進(jìn)行傳代

1. 將舊培養(yǎng)液吸除，PBS 清洗兩遍后，加入 1-2mL 胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）；

2. 鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（可用吸管吸起些許胰酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，肉眼可見細(xì)胞層脫落，即消化完成，否則繼續(xù)消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落、吹散；

3. 將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 注意培養(yǎng)基 pH 值變化和細(xì)胞密度，定期換液（每周 2-3 次），待細(xì)胞密度達(dá)到 80%～90%時(shí)，重復(fù)傳代操作或者凍存。

注意事項(xiàng)：細(xì)胞具有密度依賴性，首次傳代（密度達(dá)到 80%），建議1:2 傳代（保持細(xì)胞密度），且優(yōu)先在 T25 瓶中。密封培養(yǎng)瓶的話，處理完后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松。

三、細(xì)胞凍存

收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。步驟如下：

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL。

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清，用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞放入-80℃冰箱中，24h后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。