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松原h(huán)ESC-H9人胚胎干細(xì)胞

其它名稱: WA 09; WA-09; WA9; H9; H9.hESCs; H9 ESC; H9 hES; H9ES; GE09; WAe003-A; WICELLe003-A; WAe009-A; WA09-PCBC; PCBC02hse2014030502; SC14-067; UKERe008-A

產(chǎn)品編號(hào): CL-484h

價(jià)格: ¥4980

規(guī)格:
1×10?cells
數(shù)量: - +

詳細(xì)介紹

hESC-H9人類胚胎干細(xì)胞

產(chǎn)品編號(hào):CL-484h

 

細(xì)胞名稱

H9

細(xì)胞描述

人胚胎干細(xì)胞,曾用名WA09

態(tài)

球形克隆,貼壁生長(zhǎng)

來源性別

組織

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

凍存日期/代數(shù)

詳見 凍存管/培養(yǎng)瓶 標(biāo)識(shí)

建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系

1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶6cm培養(yǎng)皿

細(xì)胞狀態(tài)

良好

支原體檢測(cè)結(jié)果

陰性

細(xì)胞用途

僅供科研使用。

STR鑒定結(jié)果:

Amelogenim

X

D5S818

11,12

D13S317

9

D7S820

9,11

D16S539

12,13

VWA

17

TH01

9

TPOX

10,11

CSF1PO

11

 

H9細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞

1.試劑和材料

H9細(xì)胞完全培養(yǎng)基試劑盒(貨號(hào):CM-484h)

成分

規(guī)格

數(shù)量

儲(chǔ)存條件

H9細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基

500mL

1

2-8

H9細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑

20mL

1

-20

 

所需的其它試劑和材料

產(chǎn)品

規(guī)格

貨號(hào)

品牌

Y27632

1mg

RC-CA005

SAIOS

Matrigel

5mL

ipsMed-CA004

SAIOS

H9細(xì)胞消化液

500mL

H9Med-CA003

SAIOS

細(xì)胞專用凍存液

100mL

iPSCMED-CA009

SAIOS

另需細(xì)胞培養(yǎng)皿//板,15mL離心管和移液管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材

 

2.培養(yǎng)流程

2.1試劑的制備

2.1.1 完全培養(yǎng)基制備

2.1.1在室溫15-25℃或冰箱內(nèi)(2-8℃過夜解凍細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑,可在無(wú)菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份,并在-20℃下凍存。冷凍的分量須在3個(gè)月內(nèi)用完。解凍后的分量應(yīng)該一天內(nèi)制備成完全培養(yǎng)基。請(qǐng)勿在解凍后再次冷凍。

2.1.2.在無(wú)菌條件下將20mL的添加劑全部解凍后加入到500mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,充分混勻。完全培養(yǎng)基在(2-8℃)下儲(chǔ)存時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多2-3周,或在-20℃下冷凍時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多3個(gè)月。在室溫(15-25℃)或冰箱內(nèi)2-8℃過夜解凍冷凍的培養(yǎng)基,不要長(zhǎng)時(shí)間放在37℃水浴內(nèi)加熱培養(yǎng)基。

如果在無(wú)菌條件下制備,細(xì)胞完全培養(yǎng)基可直接使用。

2.1.2 Matrigel工作液的配制與包被

于基質(zhì)膠的操作環(huán)境要求比較嚴(yán)格,為保證您的實(shí)驗(yàn)順利,特此對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行溫馨提示:

1. 收貨時(shí),首先確認(rèn)還有干冰,Matrigel成固態(tài),液面水平,如有異常請(qǐng)及時(shí)拍照取證并聯(lián)系我們。

2. 整個(gè)Matrigel只能分裝一次,在分裝前,要先放4℃冰箱(最好先把Matrigel插在冰上,然后放入4℃冰箱過夜,且分裝用的槍頭、EP管等都要提前-20℃預(yù)冷(基質(zhì)膠在10℃以上會(huì)發(fā)成膠凝固導(dǎo)致基質(zhì)膠報(bào)廢),整個(gè)分裝過程都需在冰上進(jìn)行,且以后每次試驗(yàn)時(shí)拿出本次用量所需的基質(zhì)膠。

3. 實(shí)驗(yàn)人員手心不要接觸基質(zhì)膠,如:要手持裝有MatrigelEP管的上方,防止體溫使基質(zhì)膠成膠凝固。 

4. Matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。

本庫(kù)建議的配制Matrigel工作液方法:

1. 稀釋前將Matrigel放入4℃冰箱過夜融化。

2. 將適量體積的稀釋液(DMEM/F12PBS)置4℃冰箱預(yù)冷。

3. 將融化的Matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開蓋子,用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管,并吸取少量稀釋液加入Matrigel管中混勻,將Matrigel轉(zhuǎn)移到稀釋液中,并吹打混勻。(因?yàn)?/span>Matrigel15℃以上溫度就會(huì)成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上,故Matrigel從冰箱拿出來以后盡快打開蓋子并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的稀釋液中,吸取Matrigel的移液管一定要冷卻)。

4. 立即用稀釋后的Matrigel包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。對(duì)于6孔板,每個(gè)孔使用1mL稀釋后的Matrigel,對(duì)于6cm的培養(yǎng)皿,每個(gè)孔使用2mL稀釋后的Matrigel,晃動(dòng)培養(yǎng)板使Matrigel溶液均勻的分布在表面上。

5. 使用前,包被的培養(yǎng)板應(yīng)放在培養(yǎng)箱(37℃)下至少1h。請(qǐng)勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前,請(qǐng)勿移除Matrigel溶液。

如果不立即使用,培養(yǎng)板必須密封,以防止脫水。包被后的培養(yǎng)板可在2-8℃下最多儲(chǔ)存7天。

如果Matrigel溶液并未完全覆蓋表面,則無(wú)法實(shí)驗(yàn)最佳的細(xì)胞培養(yǎng),因此,不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板。

如果已將培養(yǎng)板在2-8℃下儲(chǔ)存,則在移除Matrigel溶液之前,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱(37℃)下放置30min

2.1.3 Y27632的配制

Y27632粉末溶解在PBS中,配制成濃度未10mM的儲(chǔ)存液,0.22μm濾膜過濾除菌。分裝后冷凍于-20℃。

Y27632提高復(fù)蘇和傳代后的克隆形成率,所以只在復(fù)蘇和傳代步驟添加(1:1000,即終濃度為10μM),換液時(shí)不添加。

 

2.1.復(fù)蘇

在開始復(fù)蘇前,將所有試管、預(yù)熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準(zhǔn)備好,已確保盡快完成復(fù)蘇過程。

1. 將凍存管從液氮中取出,快速在37℃水浴槽中解凍,輕柔持續(xù)地?fù)u動(dòng)凍存管,直到只剩下一個(gè)小冷凍團(tuán)。從水浴槽取出凍存管,70%乙醇擦拭進(jìn)行消毒。

2. 使用移液管將凍存管中含有H9細(xì)胞的凍存液輕輕轉(zhuǎn)移至一個(gè)含有5-6mL已經(jīng)預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的15mL離心管中,過程必須輕柔防止吹散細(xì)胞團(tuán)。

3. 室溫300g離心5min。

4. 吸出培養(yǎng)基,確保細(xì)胞團(tuán)完整。

5. 然后緩慢加入1mL完全培養(yǎng)基,用手指輕彈離心管底部,使細(xì)胞團(tuán)脫離底部并分散。

6. 輕輕的將此1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至已包被的培養(yǎng)皿//瓶,根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積,加入ROCK inhibitor Y27632,終濃度為10μM。

7. 將培養(yǎng)皿//瓶置于37℃培養(yǎng)箱中,每天更換培養(yǎng)基(換液不需要再添加Y27632,但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱)。

2.2.傳代

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮(對(duì)比邊緣),相鄰的集落開始融合時(shí),此時(shí)可進(jìn)行傳代。

1. 傳代,準(zhǔn)備37 ℃預(yù)熱好的無(wú)鈣鎂 PBS 溶液及消化液,完全培養(yǎng)基。

2. 吸走上清,并加入37℃預(yù)熱好的PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL10cm 皿加 3mL 的量 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min,用手指輕彈皿/板/瓶身,顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

5. 加入適量完全培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管,300g離心5min

7. 離心后重懸(重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步)。

8. 傳代比例為 1618,根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積,加入ROCK inhibitor Y27632,終濃度為10μM。

9. 將培養(yǎng)皿//瓶置于37℃培養(yǎng)箱中,每天更換培養(yǎng)基(換液不需要再添加Y27632,但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱)。

2.3.凍存

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮(對(duì)比邊緣),相鄰的集落開始融合時(shí),此時(shí)可進(jìn)行傳代。

1. 傳代,準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無(wú)鈣鎂 PBS 溶液及消化液,完全培養(yǎng)基。

2. 吸走上清,并加入 37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL,10cm 皿加 3mL 的量 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min,用手指輕彈皿/板/瓶身,顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

5. 加入適量完全培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管,300g離心5min

7. 離心后重懸(重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步)。

8. 使用預(yù)冷的凍存液輕輕的重懸細(xì)胞團(tuán),然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管,凍存按 6 孔板每孔凍 1 支,6cm 皿凍 2-4 支,10cm 皿凍 6-12


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