PMVEC 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

產(chǎn)品編號(hào)：CL-046r

一、細(xì)胞特性

來源：大鼠

形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣，短梭形，貼壁生長(zhǎng)

含量：>1x10?cells

規(guī)格：T25瓶x1（常溫運(yùn)輸）/2mL凍存管x2（干冰運(yùn)輸）

用途：本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用，不可用于動(dòng)物或人類治療或診斷用途

二、完全培養(yǎng)基及凍存液配制

1) 該細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：89%DMEM + 10%FBS + 1%P/S。

2) 培養(yǎng)環(huán)境：氣相：5%CO?+95%AIR；溫度：37℃；培養(yǎng)箱濕度：70-80%。

3) 凍存液：90%血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

三、收貨注意事項(xiàng)

1) 凍存細(xì)胞：收貨后檢查干冰融化、凍存管是否破損及瓶蓋脫落情況。如無異常情況，1支凍存管按照說明書要求盡快復(fù)蘇，另一支-80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮保存，如果第一支復(fù)蘇效果不理想，需及時(shí)聯(lián)系反饋，在我方技術(shù)指導(dǎo)下復(fù)蘇第二支凍存細(xì)胞。

2) 復(fù)蘇細(xì)胞：收到細(xì)胞后，用75%酒精消毒瓶壁，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中靜置2-3h以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、檢查有無微生物污染現(xiàn)象、拍照記錄不同倍數(shù)鏡下細(xì)胞狀態(tài)，前三天所拍照片將作為售后服務(wù)依據(jù)。

3) 對(duì)于貼壁的細(xì)胞：①顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在運(yùn)輸過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。②鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度若<80%，可去除培養(yǎng)瓶中舊液（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中），加入新的完全培養(yǎng)基6-8mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶若為密封瓶蓋須擰松瓶蓋。③如果細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)滿請(qǐng)立即傳代（若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收）。

細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

一、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存管從液氮或-80℃中取出放入PE手套中，迅速?zèng)]入37℃水浴鍋，搖晃凍存管加速溶解，以1min內(nèi)全部溶解為宜，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mL完全培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶（或6cm皿）中，37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

注意：在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和佩戴防護(hù)面罩，避免凍存管爆炸造成人員傷害。

二、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代，步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入1-2mL胰蛋白酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）至培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，1000rpm離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按      1: 2比例分到2個(gè)新的T25瓶中，添加6-8mL/瓶完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1: 2~1: 5的比例進(jìn)行。

三、細(xì)胞凍存

收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。步驟如下：

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL。

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清，用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全柜內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。