人胚胎干細胞（綠熒光）H9-GFP說明書

貨號：CL-484h-gfp

規(guī)格：1×10? cells

儲存條件：液氮儲存

產(chǎn)品簡介：

賽奧斯（SAIOS）提供的人胚胎干細胞（綠熒光）H9-GFP在無飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確并且無動物源成分的人胚胎干細胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，適合臨床級細胞研究和應(yīng)用。人胚胎干細胞在此培養(yǎng)體系中可以長期穩(wěn)定快速增殖，具有典型的人胚胎干細胞克隆形態(tài)，表達多潛能標志物基因，長期維持正常核型，并在體內(nèi)外具有三胚層分化潛能。

產(chǎn)品內(nèi)容：

構(gòu)建方法：

本產(chǎn)品是由人胚胎干細胞H9進行基因編輯獲得的能表達綠色熒光蛋白（GFP）的工具細胞系。AAVS1位點是位于人19號染色體上的一個開放位點，在該位點插入外源基因不會對細胞的功能有影響，且支持轉(zhuǎn)基因片段在此位點長期穩(wěn)定地表達，因此被廣泛采用。

本產(chǎn)品是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效特異性切割和同源重組原理，在AAVS1位點插入綠色熒光蛋白 （GFP）的序列，以實現(xiàn)GFP的表達。

細胞傳代比例：

· 通常早代次（<10代）的干細胞需要以較低的比例傳代，如1:2～1:4；成功建系的干細胞（10代以上）可以1:6～1:10的比例傳代，傳代的比例由細胞株的生長速率決定。

· 比較理想的傳代時間間隔是3～6天一次。

細胞傳代操作流程：

1. 將人胚胎干細胞完全培養(yǎng)基取出并平衡至室溫，取出包被過人胚胎干細胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱中。

       注：初次進行傳代操作的客戶，建議將其中一個孔加入復(fù)蘇完全培養(yǎng)基。

2. 吸走待傳代細胞培養(yǎng)皿/瓶中的完全培養(yǎng)基，并且加入無鈣鎂的PBS溶液洗一次。

3. 加入人胚胎干細胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底。

4. 37℃恒溫CO₂細胞培養(yǎng)箱中孵育4～6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內(nèi)部大部分細胞間出現(xiàn)較為明顯的間隙，肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細胞消化時間理想。

5. 吸去消化液，即刻加入新鮮的人胚胎干細胞完全培養(yǎng)基，用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的干細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻。

注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)總共不超過10次為宜。吹打過度導(dǎo)致大量單細胞 出現(xiàn)是造成細胞分化或死亡的重要原因。

注：如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

6. 顯微鏡下觀察細胞呈4～20個細胞大小的團塊，水平十字搖勻。于室溫放置10～15分鐘。

7. 顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后將細胞置于37℃恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

8. 每天換液直至達到可以傳代的標準。