一.細胞介紹
該細胞來源于人靜脈內(nèi)皮,可在半固體培養(yǎng)基中形成克隆,在免疫抑制小鼠中不能形成腫瘤。該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶GFP基因。
二.細胞特性
(1)來源:人臍帶組織。
(2)形態(tài):內(nèi)皮細胞樣 貼壁生長。
(3)含量:>1x10?cells。
(4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
三.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
(1)準(zhǔn)備內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基:內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 93%,胎牛血清(FBS) 5%,內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑 1%,青霉素/鏈霉素,P/S 1%。永生化人臍靜脈內(nèi)皮細胞+GFP(HUVEC+GFP)的體外培養(yǎng),建議使用本公司配套的專用培養(yǎng)基和正確的培養(yǎng)方法來解凍、傳代,以此保證細胞具備良好的增殖和分化能力。推薦使用:原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(貨號:PM-002)。
(2)培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
(3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。
四.運輸和保存
(1)凍存細胞:1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。
(2)復(fù)蘇好的活細胞:T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨,收到后按照細胞接收后的處理方法操作。
五.產(chǎn)品用途
本產(chǎn)品只提供給進一步的科研使用,不可應(yīng)用于治療等其他方面。
細胞接收后的處理:
(1)收到細胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染,請拍照后及時聯(lián)系我們。
(2)請在4或5x顯微鏡下確認細胞狀態(tài),同時給剛收到的細胞拍照(10×,20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。
(3)貼壁細胞:細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況,有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下,可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基(若有未貼壁的細胞需要離心回收,重懸打入到原培養(yǎng)瓶中),加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL,放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上,可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中,若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。
(4)注意:運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞,請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1:2傳代。
細胞處理:
(1)凍存細胞的復(fù)蘇:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
(2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培養(yǎng)瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘(難消化的細胞可以適當(dāng)延長消化時間),然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8mL按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
(3)細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
下面以T25瓶為例:
(1)細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,可使用血球計數(shù)板計數(shù),來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個活細胞/mL。
(2)1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞,按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個活細胞/mL分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中,標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
(3)將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,-80℃冰箱中過夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存,同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
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