人胚胎干細(xì)胞（綠熒光）H9-GFP說明書

貨號(hào)：CL-484h-gfp

規(guī)格：1×10? cells

儲(chǔ)存條件：液氮儲(chǔ)存

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

賽奧斯（SAIOS）提供的人胚胎干細(xì)胞（綠熒光）H9-GFP在無(wú)飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確并且無(wú)動(dòng)物源成分的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，適合臨床級(jí)細(xì)胞研究和應(yīng)用。人胚胎干細(xì)胞在此培養(yǎng)體系中可以長(zhǎng)期穩(wěn)定快速增殖，具有典型的人胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)，表達(dá)多潛能標(biāo)志物基因，長(zhǎng)期維持正常核型，并在體內(nèi)外具有三胚層分化潛能。

產(chǎn)品內(nèi)容：

構(gòu)建方法：

本產(chǎn)品是由人胚胎干細(xì)胞H9進(jìn)行基因編輯獲得的能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的工具細(xì)胞系。AAVS1位點(diǎn)是位于人19號(hào)染色體上的一個(gè)開放位點(diǎn)，在該位點(diǎn)插入外源基因不會(huì)對(duì)細(xì)胞的功能有影響，且支持轉(zhuǎn)基因片段在此位點(diǎn)長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)，因此被廣泛采用。

本產(chǎn)品是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效特異性切割和同源重組原理，在AAVS1位點(diǎn)插入綠色熒光蛋白 （GFP）的序列，以實(shí)現(xiàn)GFP的表達(dá)。

細(xì)胞傳代比例：

· 通常早代次（<10代）的干細(xì)胞需要以較低的比例傳代，如1:2～1:4；成功建系的干細(xì)胞（10代以上）可以1:6～1:10的比例傳代，傳代的比例由細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率決定。

· 比較理想的傳代時(shí)間間隔是3～6天一次。

細(xì)胞傳代操作流程：

1. 將人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基取出并平衡至室溫，取出包被過人胚胎干細(xì)胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

       注：初次進(jìn)行傳代操作的客戶，建議將其中一個(gè)孔加入復(fù)蘇完全培養(yǎng)基。

2. 吸走待傳代細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶中的完全培養(yǎng)基，并且加入無(wú)鈣鎂的PBS溶液洗一次。

3. 加入人胚胎干細(xì)胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底。

4. 37℃恒溫CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)較為明顯的間隙，肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細(xì)胞消化時(shí)間理想。

5. 吸去消化液，即刻加入新鮮的人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻。

注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)總共不超過10次為宜。吹打過度導(dǎo)致大量單細(xì)胞 出現(xiàn)是造成細(xì)胞分化或死亡的重要原因。

注：如有少量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，需延長(zhǎng)消化時(shí)間。

6. 顯微鏡下觀察細(xì)胞呈4～20個(gè)細(xì)胞大小的團(tuán)塊，水平十字搖勻。于室溫放置10～15分鐘。

7. 顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后將細(xì)胞置于37℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

8. 每天換液直至達(dá)到可以傳代的標(biāo)準(zhǔn)。