UMNSAH/DF-1雞胚成纖維細(xì)胞

產(chǎn)品編號(hào)：CL-010e

一、細(xì)胞介紹

該細(xì)胞是起源于10日齡的ELL-0雞蛋的雞細(xì)胞株，自發(fā)永生化。分離原代雞胚成纖維細(xì)胞并在培養(yǎng)液中培養(yǎng)；傳代直到衰老；在衰老過(guò)程中離心以保持細(xì)胞培養(yǎng)在30%到60%匯合度；不衰老的克隆進(jìn)行鑒定并傳代不少于30次。在軟瓊脂上沒(méi)有觀察到克隆增殖，說(shuō)明這些細(xì)胞是永生化而沒(méi)有轉(zhuǎn)化。該細(xì)胞可作為病毒增殖、重組蛋白表達(dá)和重組病毒生產(chǎn)的基質(zhì)。

二、細(xì)胞特性

來(lái)源：雞胚

形態(tài)：成纖維細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)

含量：>1x10?cells

規(guī)格：T25瓶x1（常溫運(yùn)輸）/2mL凍存管x2（干冰運(yùn)輸）

用途：本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用，不可用于動(dòng)物或人類(lèi)治療或診斷用途

三、完全培養(yǎng)基及凍存液配制

1) 該細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：DMEM(含1.5g/L NaHCO?)培養(yǎng)基 + 10%FBS + 1%P/S

2) 培養(yǎng)環(huán)境：39℃，95% Air，5% CO?

3) 凍存液：90%血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配

注意：細(xì)胞凍存后復(fù)蘇存活率只有50%左右，建議加大凍存密度。該細(xì)胞在低濃度NaHCO?（1.5g/L）的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，大部分品牌的DMEM含有較高濃度的NaHCO?（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/L NaHCO?）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提高CO?濃度（7%-10%）。

四、收貨注意事項(xiàng)

1) 凍存細(xì)胞：收貨后檢查干冰融化、凍存管是否破損及瓶蓋脫落情況。如無(wú)異常情況，1支凍存管按照說(shuō)明書(shū)要求盡快復(fù)蘇，另一支轉(zhuǎn)入液氮儲(chǔ)存。如果第一支復(fù)蘇效果不理想，需及時(shí)聯(lián)系反饋，在我方技術(shù)指導(dǎo)下復(fù)蘇第二支凍存細(xì)胞。

2) 復(fù)蘇細(xì)胞：收到細(xì)胞后，用75%酒精擦拭T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶外部，不拆封口膜將培養(yǎng)瓶放入39℃，5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2-3h以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、檢查有無(wú)微生物污染現(xiàn)象、拍照記錄不同倍數(shù)鏡下細(xì)胞狀態(tài)，前三天所拍照片將作為售后服務(wù)依據(jù)。

3) 對(duì)于貼壁的細(xì)胞：①靜置后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。②若細(xì)胞匯合度未超過(guò)80%，可去除培養(yǎng)瓶中舊液（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中），加入新的完全培養(yǎng)基5mL，放入39℃，5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，若培養(yǎng)瓶為密封瓶蓋須擰松瓶蓋。③若細(xì)胞匯合度超過(guò)80%，請(qǐng)立即傳代（若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收），首次傳代，建議 1:2 傳代（兩個(gè)T25）。

細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

一、細(xì)胞復(fù)蘇

1. 將細(xì)胞凍存管快速放入39℃水浴中解凍，輕輕搖晃加速溶解，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁。

2. 將凍存管內(nèi)容物加入到含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min。

3. 棄去上清液，用5mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種到T25培養(yǎng)瓶，放入39℃，5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

注意：在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和佩戴防護(hù)面罩，避免凍存管爆炸造成人員傷害。

二、細(xì)胞傳代

1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25% (w/v) 胰蛋白酶- 0.53 mM EDTA 約1mL至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min。

3. 棄去上清液，細(xì)胞沉淀用1-2mL完全培養(yǎng)基重懸，然后按1：2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25），補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8mL/瓶，放入39℃，5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。步驟如下：

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL。

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清，用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞放入程序降溫盒中，-80℃冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全柜內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。