Ect1/E6E7 人宮頸外口鱗狀上皮細(xì)胞

產(chǎn)品編號(hào)：CL-693h

一、細(xì)胞介紹

宮頸外Ect1/E6E7(ATCC CRL-2614 )和宮頸內(nèi)End1/E6E7(ATCC CRL-2615)細(xì)胞系于1996年由DAnderson, RN Fichorova JG Rheinwald從一名43歲白人女性，因子宮內(nèi)膜異位癥行子宮切除術(shù)的絕經(jīng)前婦女的正常上皮組織中建立。VK2/E6E7(ATCC CRL-2616細(xì)胞系于1996 年從一名接受前后陰道修復(fù)手術(shù)的絕經(jīng)前婦女的正常陰道粘膜組織中建立。在聚凝胺存在下，通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN-16E6E7轉(zhuǎn)導(dǎo)使第3代的細(xì)胞永生化。在有 G418的培養(yǎng)基中選擇克隆。細(xì)胞系可以為有效的、可重復(fù)的體外模型提供基礎(chǔ)，用于研究宮頸陰道生理學(xué)和感染以及測試用于陰道內(nèi)應(yīng)用的藥物。

二、細(xì)胞特性

來源：43歲女性宮頸陰道上皮

形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長

含量：>1x10?cells

規(guī)格：T25瓶x1（常溫運(yùn)輸）/ 含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管x2（干冰運(yùn)輸）

用途：本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用，不可用于動(dòng)物或人類治療或診斷用途

三、完全培養(yǎng)基及凍存液配制

1) 該細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (GIBCO-BRL 17005-042)，含 0.1 ng/ml 人重組 EGF、0.05 mg/ml 牛垂體提取物和額外的氯化鈣 44.1 mg/L（最終濃度為 0.4 mM）

2) 培養(yǎng)環(huán)境：37℃，95% Air，5% CO?

3) 凍存液：90%血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配

四、收貨注意事項(xiàng)

1) 收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液體溢出及細(xì)胞有污染，凍存細(xì)胞若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落，請(qǐng)拍照后及時(shí)與我們聯(lián)系。

2) 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)時(shí)，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度?？醇?xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?0X和20×物鏡下，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3) 觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4) 對(duì)于貼壁生長的細(xì)胞：①靜置后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在運(yùn)輸過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。②若細(xì)胞匯合度未超過80%，可去除培養(yǎng)瓶中舊液（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中），加入新的完全培養(yǎng)基5mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（若培養(yǎng)瓶為密封瓶蓋須擰松瓶蓋）。③若細(xì)胞匯合度超過80%，請(qǐng)立即傳代（若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收），首次傳代，建議 1:2 傳代（兩個(gè)T25）。

細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

一、細(xì)胞復(fù)蘇

1. 將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管快速放入37℃水浴中解凍，輕輕搖晃加速溶解，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%酒精擦拭凍存管外壁。

2. 將凍存管內(nèi)容物加入到含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm離心5min。

3. 棄去上清液，補(bǔ)加 4-6mL 完全培養(yǎng)基后吹勻，接種于T25培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

4. 第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

注意：在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和佩戴防護(hù)面罩，避免凍存管爆炸造成人員傷害。

二、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化3-4min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后，加 5mL 以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3. 輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出至離心管中，1000rpm 離心 5-8min，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 完全培養(yǎng)基后吹勻。

4. 按5-6mL/瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按 1:2 ~ 1:3 的比例分到新的含 5-6 mL 完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中或者培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。步驟如下：

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL。

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清，用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞放入程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全柜內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。