一.細(xì)胞詳述

 根據(jù)不同來(lái)源及分化階段，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞具有分化為多種不同組織的能力，但在倫理上存在爭(zhēng)議。成體干細(xì)胞因其來(lái)源廣泛、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為組織工程學(xué)研究的優(yōu)選種子細(xì)胞。其中，脂肪干細(xì)胞作為組織工程修復(fù)的種子細(xì)胞，因其具有來(lái)源豐富、取材容易、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正受到越來(lái)越多的關(guān)注。

脂肪干細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖能力。在一定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，具有多向分化潛能。

該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Tert基因。

二.細(xì)胞特性

1) 組織來(lái)源于人的正常脂肪組織。

2) 細(xì)胞鑒定：CD44免疫熒光染色為陽(yáng)性，CD45免疫熒光染色為陰性。

3) 經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。

4) 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。

5) 細(xì)胞生長(zhǎng)方式：長(zhǎng)梭形細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。

三.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

（1）永生化人脂肪干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，建議使用本公司配套的專用培養(yǎng)基和正確的培養(yǎng)方法來(lái)解凍、傳代，以此保證細(xì)胞具備良好的增殖和分化能力。推薦使用：原代間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號(hào)：PM-012）。

（2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

四.運(yùn)輸和保存

（1）凍存細(xì)胞：1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）復(fù)蘇好的活細(xì)胞：T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

五.產(chǎn)品用途

本產(chǎn)品只提供給進(jìn)一步的科研使用，不可應(yīng)用于治療等其他方面。

細(xì)胞接收后的處理：

（1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

（2）請(qǐng)?jiān)?或5x顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

（3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

（4）注意：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

細(xì)胞處理：

（1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

（2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8mL按照說(shuō)明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

（3）細(xì)胞凍存：收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面以T25瓶為例：

（1）細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL。

（2）1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

（3）將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存，同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。