iPSC多功能誘導(dǎo)干細(xì)胞

產(chǎn)品編號(hào)：SC-DRY0100

iPS細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)說明

1.試劑和材料

hiPSC完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：iPSCMed-001）

所需的其它試劑和材料

2.培養(yǎng)流程

2.1.復(fù)蘇

在開始復(fù)蘇前，將所有試管、預(yù)熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準(zhǔn)備好，已確保盡快完成復(fù)蘇過程。

1. 將凍存管從液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解凍，輕柔持續(xù)地?fù)u動(dòng)凍存管，直到只剩下一個(gè)小冷凍團(tuán)。從水浴槽取出凍存管，75%酒精擦拭進(jìn)行消毒。

2. 使用移液管將凍存管中含有iPS細(xì)胞的凍存液輕輕轉(zhuǎn)移至一個(gè)含有5-6mL已經(jīng)預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的15mL離心管中，過程必須輕柔防止吹散細(xì)胞團(tuán)。

3. 室溫300g離心5min。

4. 吸出培養(yǎng)基，確保細(xì)胞團(tuán)完整。

5. 然后緩慢加入1mL完全培養(yǎng)基，用手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞團(tuán)脫離底部并分散。

6. 輕輕的將此1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至已包被的培養(yǎng)皿/板/瓶。

7. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。

2.2.傳代

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣），相鄰的集落開始融合時(shí)，此時(shí)可進(jìn)行傳代。

1.傳代前，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂PBS 溶液及消化液，完全培養(yǎng)基。

2. 吸走上清，并加入37℃預(yù)熱好的PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

5. 加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管，300g離心5min。

7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。

8. 傳代比例為 1：6—1：8，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM。

9. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。

2.3.凍存

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣），相鄰的集落開始融合時(shí)，此時(shí)可進(jìn)行傳代。

1. 傳代前，準(zhǔn)備37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂 PBS 溶液及消化液，完全培養(yǎng)基。

2. 吸走上清，并加入37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

5. 加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管，300g離心5min。

7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。

8. 使用預(yù)冷的凍存液輕輕的重懸細(xì)胞團(tuán)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管，凍存按 6 孔板每孔凍 1 支，6cm 皿凍 2-4 支，10cm 皿凍 6-12 支。