細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

一、儀器與試劑

二、操作流程

復(fù)蘇

1) 將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；

2) 準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；

3) 戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；

4) 將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；

5) 準(zhǔn)備一個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，寫(xiě)上細(xì)胞名稱、日期，再加入4ml完全培養(yǎng)基；

6) 離心完成后棄去上清，用1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T-25細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

傳代（細(xì)胞傳代建議一傳二）

1) 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。

2) 在生物安全柜內(nèi)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

3) 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml無(wú)菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；

4) 向瓶?jī)?nèi)加入消化液1ml，浸潤(rùn)底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1~2min；

5) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來(lái)則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入15ml離心管；

    注：如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化：

    ① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的15ml離心管，加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基；

    ② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；

    ③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1ml胰酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。

6) 1000rpm離心5min；

7) 準(zhǔn)備兩個(gè)新的T-25培養(yǎng)瓶，各加入4ml完全培養(yǎng)基。

8) 離心完成后，棄上清，用2ml完全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶各1ml；

9) 水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

凍存（細(xì)胞凍存建議每瓶T25凍一支）

1）~6）參照傳代步驟

7）離心完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.8ml凍存管中；

8）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過(guò)夜降溫；

9）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。