原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

一、組織塊直接培養(yǎng)法

1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。

2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3左右的小塊，再用Hank's液洗三次。

3、將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面。

4、輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，向瓶內(nèi)注入適量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放置在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

5、放置待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

二、消化培養(yǎng)法

1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。

2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3左右的小塊，再用Hank's液洗三次。

3、視組織塊量加入酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。

4、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關(guān)酶抑制劑）。

5、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

6、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

7、加入Hank's液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。

8、加入培養(yǎng)液1—2ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

9、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

三、 器官培養(yǎng)

1、將不銹網(wǎng)做成支架形狀，調(diào)整其高度至培養(yǎng)皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。

2、將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。

3、將要培養(yǎng)器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2。

4、將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO2培養(yǎng)箱，并加注氧氣調(diào)整氧分壓，建議到90%。

5、培養(yǎng)過程中要注意觀察培養(yǎng)液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。

6、上述可進(jìn)行器官培養(yǎng)1-3周，每2-3天換液一次，并根據(jù)情況做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和檢測。