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原代細胞永生化定制
指動物、人的原代細胞受到病毒感染、外源基因插入、輻射或藥物作用后，細胞分裂能力從有限的倍增次數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢詿o限體外擴增的能力。該項技術(shù)的出現(xiàn)極大的豐富了人們對于珍貴的、不能體外大量擴增細胞的來源。
實驗信息表： | ||||
產(chǎn)品名稱 | SV40過表達慢病毒 | |||
載體信息 | 載體元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
攜帶熒光標記 | GFP □ RFP□ | 抗性基因標記 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
載體圖譜 |
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載體目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區(qū)域為目的序列區(qū) | ||||
（1）將細胞接種6孔板，每孔細胞數(shù)約為1×105 個，
（2）第二天，待細胞貼壁后，換液，
（3）加入1mL完全培養(yǎng)基，再加20 μL SV40過表達慢病毒，
（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，
（5）12h后觀察細胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基，
（6）當細胞長滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。
細胞轉(zhuǎn)染圖片如下：
（1）將未轉(zhuǎn)染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細胞的24孔板，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，
（5）每天觀察細胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內(nèi)殺死所有細胞的最低篩選濃度。
結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2ug/mL，作用時間2d。
（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的篩選培養(yǎng)基，孵育，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，
（5）每天觀察細胞的存活比例，
（6）在同一時間點（2d）存活的細胞，即為轉(zhuǎn)染成功的細胞，
（7）對篩選后的細胞進行擴增。
將篩選后的細胞進行擴增，篩選后的細胞為P1代，擴增至少到12代。
永生化的細胞圖片如下：
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